Методы определения активности ферментов различных классов. Изменение ферментативной активности почв при нефтяном загрязнении Природа почвенных ферментов

Из многочисленных показателей биологической активности почвы большое значение имеют почвенные ферменты. Их разнообразие и богатство делают возможным осуществление последовательных био­химических превращений, поступающих в почву органических остат­ков.

Название «фермент» происходит от латинского «ферментум» - брожу, закваска. Явление катализа и в настоящее время полнос­тью не разгадано. Сущность действия катализатора заключается в снижении энергии активации, необходимой для химической ре­акции, направляя ее обходным путем через промежуточные ре­акции, которые требуют меньшей энергии, идущие без катализа­тора. Благодаря этому повышается и скорость основной реакции.

Под действием фермента ослабляются внутримолекулярные связи в субстрате вследствие некоторой деформации его молекулы, про­исходящей при образовании промежуточного комплекса фермент-субстрата.

Ферментативную реакцию можно выразить общим уравнением:

E+S -> ES -> Е+Р,

т. е. субстрат (S) обратимо реагирует с ферментом (Е) с образованием фермент-субстратного комплекса (ES). Общее ускорение реакции под действием фермента обычно составляет 10 10 -10 15 .

Таким образом, роль ферментов заключается в том, что они зна­чительно ускоряют биохимические реакции и делают их возможными при обычной нормальной температуре.

Ферменты, в отличие от неорганических катализаторов, облада­ют избирательностью действия. Специфичность действия ферментов выражается в том, что каждый фермент действует лишь на опреде­ленное вещество, или же на определенный тип химической связи в молекуле. По своей биохимической природе все ферменты - высо­комолекулярные белковые вещества. На специфичность ферментных Силков влияет порядок чередования в них аминокислот. Некоторые ферменты помимо белка содержат более простые соединения. На­пример, в составе различных окислительных ферментов содержат­ся органические соединения железа. В состав других входят медь, цинк, марганец, ванадий, хром, витамины и другие органические соединения.

В основу единой классификации ферментов положена специфич­ность к типу реакции, и в настоящее время ферменты подразделяют на 6 классов. В почвах наиболее изучены оксидоредуктазы (катали­зируют процессы биологического окисления) и гидролазы (катали­зируют расщепление с присоединением воды). Из оксидоредуктаз в почве наиболее распространены каталаза, дегидрогеназы, фенолоксидазы и др. Они участвуют в окислительно-восстановительных про­цессах синтеза гумусовых компонентов. Из гидролаз наиболее широ­ко в почвах распространены инвертаза, уреаза, протеаза, фосфата-Mi. Эти ферменты участвуют в реакциях гидролитического распада высокомолекулярных органических соединений и тем самым играют важную роль в обогащении почвы подвижными и доступными рас­тениям и микроорганизмам питательными веществами.

Исследованием ферментативной активности почв занималось боль­шое количество исследователей. В результате исследований доказа­но, что ферментативная активность - это элементарная почвенная характеристика. Ферментативная активность почвы складывается в результате совокупности процессов поступления, иммобилизации и действия ферментов в почве. Источниками почвенных ферментов слу­жит все живое вещество почв: растения, микроорганизмы, животные, грибы, водоросли и т. д. Накапливаясь в почве, ферменты становятся неотъемлемым реактивным компонентом экосистемы. Почва является самой богатой системой по ферментному разнообразию и фермента­тивному пулу. Разнообразие и богатство ферментов в почве позволя­ет осуществляться последовательным биохимическим превращениям различных поступающих органических остатков.

Значительную роль почвенные ферменты играют в процессах гумусообразования. Превращение растительных и животных остат­ков в гумусовые вещества является сложным биохимическим про­цессом с участием различных групп микроорганизмов, а также им­мобилизованных почвой внеклеточных ферментов. Выявлена пря­мая связь между интенсивностью гумификации и ферментативной активностью.

Особо следует отметить значение ферментов в тех случаях, когда в почве складываются экстремальные для жизнедеятельности микро­организмов условия, в частности при химическом загрязнении. В этих случаях метаболизм в почве остается в известной мере неизменным благодаря действию иммобилизированных почвой, и поэтому устой­чивых, ферментов.

Максимальная каталитическая активность отдельных ферментов наблюдается в относительно небольшом интервале рН, который явля­ется для них оптимальным. Поскольку в природе встречаются почвы с широким диапазоном реакции среды (рН 3,5-11,0), то их уровень активности весьма различен.

Исследованиями различных авторов установлено, что активность почвенных ферментов может служить дополнительным диагностиче­ским показателем почвенного плодородия и его изменения в резуль­тате антропогенного воздействия. Применению ферментативной ак­тивности в качестве диагностического показателя способствуют низ­кая ошибка опытов и высокая устойчивость ферментов при хранении образцов.

1.8.4. Биологическая активность почвы

При проведении биомониторинга и биодиагностики почв ведущи­ми являются показатели биологической активности. Под биологиче­ ской активностью следует понимать напряженность (интенсивность) всех биологических процессов в почве. Ее следует отличать от биогенности почвы - заселенности почвы различными организмами. Биологическая активность и биогенность почвы часто не совпадают друг с другом.

Биологическая активность почвы обусловлена суммарным содер­жанием в почве определенного запаса ферментов, как выделенных в процессе жизнедеятельности растений и микроорганизмов, так и ак­кумулированных почвой после разрушения отмерших клеток. Биоло­гическая активность почв характеризует размеры и направление про­цессов превращения веществ и энергии в экосистемах суши, интенсив­ность переработки органических веществ и разрушения минералов.

В качестве показателей биологической активности почв использу­ются: численность и биомасса разных групп почвенной биоты, их про­дуктивность, ферментативная активность почв, активность основных процессов, связанных с круговоротом элементов, некоторые энерге­тические данные, количество и скорость накопления продуктов жиз­недеятельности почвенных организмов.

Из-за того, что важные и всеобщие процессы, осуществляемые в почве всеми или большинством организмов (например, термогенез, количество АТФ), практически невозможно исследовать, определяют интенсивность более частных процессов, таких как выделение СО 2 , накопление аминокислот и др.

Показатели биологической активности определяют, используя раз­личные методы: микробиологические, биохимические, физиологиче­ские и химические.

Биологическая активность почв (и соответственно методов ее определения) подразделяется на актуальную и потенциальную. По­тенциальная биологическая активность измеряется в искусственных условиях, оптимальных для протекания конкретного биологического процесса. Актуальная (действительная, естественная, полевая) био­логическая активность характеризует реальную активность почвы в естественных (полевых) условиях. Измерить ее можно только непосредственно в поле.

Методы определения потенциальной биологической активности почв могут служить хорошими диагностическими показателями потен­циального плодородия почв, степени удобреиности, окультуренности, эродированно, а также загрязненности какими-либо химически­ми веществами. Однако при характеристике интенсивности биологи­ческих процессов, протекающих в естественных условиях, следует пользоваться методами для определения актуальной биологической активности, так как в реальной обстановке лимитирующие факторы (рН среды, температура, влажность и т. д.) могут резко ограничи­вать интенсивность процесса и, несмотря на большие потенциальные возможности, процесс может идти очень медленно.

Важной особенностью показателей биологической активности почв является их значительное пространственное и временное ва­рьирование, что требует при их определении большого числа по­вторных наблюдений и тщательной вариационно-статистической об­работки.

С биологической активностью почвы тесно взаимосвязаны ее фи­зические и химические свойства, такие как гумусовое состояние, структура, щелочно-кислотные условия, окислительно-восстанови­тельный потенциал и другие. Следует отметить, что физические и химические свойства характеризуют относительно консервативные накопившиеся признаки и свойства почв, биология почв располагает показателями динамических свойств, являющихся индикаторами со­временного режима жизни почв.

Для выявления негативных последствий антропогенного воздей­ствия используют мониторинг почвенного покрова. Деградационные явления прежде всего затрагивают биологические объекты, снижая биологическую активность и, в конечном счете, плодородие. По­этому использование методов биологической диагностики, позволя­ет определить негативные последствия антропогенного воздействия на ранних стадиях. Особенно это касается диагностики разных за­грязнений.

Биологические индикаторы обладают рядом преимуществ по сравнению с другими. Во-первых, это высокая чувствительность и отзывчивость на внешние воздействия, во-вторых, они позволяют проследить за негативными процессами на ранних стадиях процес­са, в третьих, только по ним можно судить о воздействиях, не под­вергающих существенному изменению вещественный состав почв

(радиоактивное и биоцидное загрязнение). К существенным недо­статкам можно отнести большую пространственную и временную вариабельность.

В настоящее время разработан большой набор биологических по­казателей, определяющих способность почвы обеспечивать растения факторами жизни, т. е. определяющих потенциальное плодородие почв, и коррелирующих с урожайностью.

Цель работы ‑ определение биологической активности почв на разном удалении от дороги по четырем ферментным системам: дегидрогеназам, каталазе, инвертазе, уреазе.

Основные понятия

Почвенно-энзимологические методы позволяют определять не количественное содержание ферментов в почве, а активность ферментов, находящихся преимущественно в адсорбированном (иммобилизованном) состоянии на поверхности почвенных коллоидов и частично в почвенном растворе.

Принципметода определения активности почвенных ферментов основан на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, рН среды и концентрации субстратов.

Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов, а также в почве. Наиболее распространены в почвах такие оксидо-редуктазы, как каталаза и дегидрогеназы, активность которых является важным показателем генезиса почв.

Каталазаразлагает на воду и молекулярный кислород ядовитую для клетки перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания живых организмов в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ.

Активность каталазы определяется газометрическим методом по объему выделившегося кислорода, основанным на измерении скорости разложения перекиси водорода при ее взаимодействии с почвой.

Дегидрогеназы ‑ ферменты, которые участвуют в процессе дыхания, отщепляя водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы переносят водород непосредственно на молекулярный кислород, другие - на какие-либо акцепторы, например на хиноны, метиленовую синь.

Для определения активности дегидрогеназы в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазана (трифенилформазан (ТФФ).

Гидролазы осуществляют реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные амидные, пептидные и др. К этому классу относятся ферменты инвертаза, уреаза и др., активность которых является важным показателем биологической активности почв и широко используется для оценки антропогенного воздействия.

Инвертаза действует на p-фруктофуранозидную связь в сахарозе, рафинозе, стахиоэе и производит расщепление сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы.

Фотоколориметрическое определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы.

Разложение органических азотистых соединений осуществляется при непосредственном участии внеклеточных ферментов. Образующийся при уреазной активности аммиак служит источником питания растений.

Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ. Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение; она образуется также в самой почве в качестве промежуточного продукта в процессе превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот.

Определение каталазной активности

Оборудование и реактивы:

Cистема для газометрии (рис. 8); 10%-й раствор Н 2 O 2 ; СаСО э.

Рис. 8 ‑ Установка для газометрического определения каталазной активности в почвенных образцах:

1 - колба, 2 - бюретка, 3 - переходник, 4 - груша с водой

Порядок выполнения работы

1. Навеску просеянной почвы 1 г внести в колбу на 100 см 3 , добавить 0,5 г СаСО 3 .

2. На дно осторожно поставить с помощью пинцета маленький стаканчик с 1,7 см 3 10%-го раствора перекиси водорода.

3. Навеску почвы смочить 4 см 3 дистиллированной воды.

4. Колбу плотно закрыть каучуковой пробкой с трубкой, соединенной с бюреткой толстостенным каучуком через тройник, снабженный зажимом. Бюретка сообщается с грушей. Бюретка и груша заполнены водой. Уровень воды в них уравновешивают и грушу закрепляют на определенной высоте.

5. Начало опыта отметить по секундомеру в момент, когда сосудик с перекисью водорода опрокинут, и вслед за этим встряхнуть содержимое колбы. Взбалтывание смеси следует продолжать во все время опыта, не касаясь непосредственно дна колбы руками. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают.

6. Количество выделившегося молекулярного кислорода учитывают в течение 1 мин при температуре 18-20 0 С.

7. Активность каталазы выражают в объеме (см 3) кислорода, выделившегося на 1 г почвы в минуту. Ошибка определения до 5%.

8. Аналогичные процедуры проделать со всеми образцами почв.

9. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв каталазой.

Таблица15 ‑ Шкала для оценки степени обогащенности почв ферментами

Определение дегидрогиназной активности

Приборы, посуда, реактивы :

Фотоколориметр; миллиметровая бумага; 0,1М раствор глюкозы; 1 %-й раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ); СаСО 3 ; этиловый спирт; трифенилформазан (ТФФ).

Порядок выполнения работы

1. Навески воздушно-сухой почвы по 1 г из каждого образца поместить в пробирки, добавить по 10 мг (на кончике шпателя) СаСО 3 , по 1 см 3 0,1 М раствора глюкозы и по 1 см 3 1%-го раствора ТТХ; содержимое каждой пробирки тщательно смешать.

2. Пробирки поместить в анаэростат и откачать воздух насосом при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин. Затем инкубировать при 30 0 С в течение 24 ч.

3. По истечении времени инкубации содержимое пробирок экстрагировать в 3-4 приема 25 см 3 этилового спирта. Для этого небольшой объем спирта внести в пробирку и встряхивать в течение 5 мин до появления красной окраски. Дать отстояться и надпочвенную жидкость профильтровать через бумажный фильтр. Добавить в пробирку следующую порцию спирта.

4. Полученный окрашенный раствор формазана колориметрировать на ФЭКе с синим светофильтром (500-600 нм).

5. Количество формазана в миллиграммах рассчитать по стандартной кривой. Для этого приготовить стандартный раствор формазана в этиловом спирте в концентрации 0,1 мг в 1 см 3 . Рабочие растворы для составления кривой приготовить путем разведений стандартного раствора (примерно 5 точек). Стандартную кривую построить на миллиметровой бумаге в системе: оптическая плотность при длине волны 500-600 нм - концентрация формазана в спирте.

6. Вычислить активность дегидрогеназы. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв дегидрогеназой.

Обработка данных

Активность дегидрогеназы (X) выражают в миллиграммах ТФФ на 10 г почвы за сутки по формуле:

где V ‑ общий объем фильтрата, 25 см 3 ;

10 ‑ пересчетный коэффициент веса почвы, г;

v ‑ произведение объемов субстрата и реагента, 1 см 3 ;

А ‑ количество ТФФ, полученное по калибровочной кривой, мг/см 3 . Ошибка определения ‑ до 8 %.

Определение инвертазной активности

Приборы, посуда, реактивы :

Фотоколориметр; 5%-й раствор сахарозы; ацетатный буфер (рН 4,7); толуол; раствор Феллинга: а ‑ 40 г CuSO 4 ×5Н 2 О растворяют в воде и доводят до 1 дм 3 , фильтруют через бумажный фильтр, б ‑ 200 г сегнетовой соли (С 4 H 4 O 6 KNa×4Н 2 О) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН и доводят до 1 дм 3

Порядок выполнения работы

1. В колбы вместимостью 50 см 3 поместить по 5 г каждого образца почвы, добавить по 10 см 3 5%-го раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 5-6 капель толуола.

2. Колбы закрыть пробками, встряхнуть, поместить в термостат при температуре 30 0 С на 24 ч и периодически встряхивать их.

3. После инкубации содержимое колб отфильтровать в мерные колбы на 25 см 3 . Довести до метки.

4. Из фильтратов взять по 6 см 3 в большие пробирки, добавить по 3 см 3 раствора сегнетовой соли и 3 см 3 раствора сернокислой меди, хорошо перемешать и кипятить на водяной бане 10 мин. Получается красный осадок.

5. Пробирки с раствором охладить в воде, содержимое отфильтровать в большие пробирки. Прозрачный фильтрат колориметрировать на ФЭК, используя светофильтр с длиной волны 630 нм, ширина кюветы 1 см.

6. Для получения калибровочной кривой приготовить стандартный раствор: 6 мг глюкозы в 1 см 3 . Разведением приготовить серию растворов. Фотоколориметрировать и построить кривую: оптическая плотность ‑ концентрация глюкозы в 1 см 3 .

7. Вычислить активность и по табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв инвертазой.

Обработка данных

Активность инвертазы (X) выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за 24 ч по формуле:

где А ‑ количество глюкозы, полученное по калибровочной кривой из оптической плотности, мг/см 3 ;

m ‑ навеска почвы, 5 г;

V ‑ общий объем фильтрата, 25 см 3 ;

v ‑ объем фильтрата, взятого для анализа, 6 см 3 .

Ошибка определения ‑ до 5 %.

Определение уреазной активности почв

Приборы, посуда, реактивы :

Фотоколориметр; 2%-й раствор мочевины в фосфатном буфере (рН = 6,7); 50%-й раствор сегнетовой соли; 50%-й раствор CCl 3 COOH (трихлоруксусная кислота); 1%-й раствор КС1; реактив Несслера; стандартный раствор NH 4 C1.

Порядок выполнения работы

1. По 5 г воздушно-сухой почвы поместить в колбы емкостью 100 см 3 , прилить по 20 см 3 2%-го раствора мочевины в фосфатном буфере (рН 6,7) и по 200 мкл толуола.

2. Колбы плотно закрыть и поместить в термостат при температуре 37 0 С на 4 ч.

3. После экспозиции прилить по 1 см 3 50%-го раствора трихлоруксусной кислоты.

4. Для вытеснения из почвы поглощенного аммиака добавить по 50 см 3 1 н. раствора хлористого калия.

5. Содержимое колб отфильтровать.

6. По 2 см 3 фильтрата поместить в мерные колбы объемом 50 см 3 , развести водой до 30 см 3 , затем прилить по 2 см 3 50%-го раствора сегнетовой соли и по 2 см 3 реактива Несслера. Колбы долить водой до метки, перемешать и окрашенный раствор колориметрировать при длине волны 400 нм.

8. Вычисляют активность уреазы.

9. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв уреазой.

Обработка данных

Активность уреазы (X) выражают в миллиграммах N-NH 4 на 1 г почвы за 4 ч по формуле:

V ‑ общий объем фильтрата, 50 см 3 ;

m - навеска почвы, 5 г.

Вопросы для самоподготовки:

1. Что такое каталазная активность?

2. Дайте оределение инвертазной активности.

3. Охарактеризуйте уреазную активность.

4. Что такое буферная смесь?

5. Принцип и сущность метода определения активности почвенных ферментов.

6. Методика отбора образцов почвы.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Таблица 1 ‑ Примерный список организмов - индикаторов сапробности

Таблица 2 ‑ Шкала частот для пересчета организмов в 100 полях на частоту

Приложение

Таблица 13. Пересчет результатов количественного учета на значение частоты

Приложение

Пример вычисления сапробности

Проба: река ниже города. Дата ________________ Сообщество: обрастания.

Sh p =3; Sh α =15; Sh β =23.

S=S(sh)/(Sh)-103/41=2,51/

Вычисление погрешности:

Интервал точности для статистической надежности 95%.

S=s±t 0,05 s S =2,51±2,02×0,1;

Похожая информация.

Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.

Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .

По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .

Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм

Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .

Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .

Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .

Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.

При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.

Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.

Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.

Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .

В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.

В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.

Ферменты - это катализаторы химических реакций белковой природы, отличающиеся специфичностью действия в отношении катализа определенных химических реакций. Они являются продуктами биосинтеза всех живых почвенных организмов: древесных и травянистых растений, мхов, лишайников, водорослей, микроорганизмов, простейших, насекомых, беспозвоночных и позвоночных животных, представленных в природной обстановке определенными совокупностями - биоценозами.

Биосинтез ферментов в живых организмах осуществляется благодаря генетическим факторам, ответственным за наследственную передачу типа обмена веществ и его приспособительную изменчивость. Ферменты являются тем рабочим аппаратом, при помощи которого реализуется действие генов. Они катализируют в организмах тысячи химических реакций, из которых в итоге слагается клеточный обмен. Благодаря им химические реакции в организме осуществляются с большой скоростью.

В настоящее время известно более 900 ферментов. Их подразделяют на шесть главных классов.

1. Оксиредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных химических групп и остатков.

3. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей.

4. Лиазы, катализирующие реакции присоединения групп по двойным связям и обратные реакции отрыва таких групп.

5. Изомеразы, катализирующие реакции изомеризации.

6. Лигазы, катализирующие химические реакции с образованием связей за счет АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты).

При отмирании и перегнивании живых организмов часть их ферментов разрушается, а часть, попадая в почву, сохраняет свою активность и катализирует многие почвенные химические реакции, участвуя в процессах почвообразования и в формировании качественного признака почв - плодородия. В разных типах почв под определенными биоценозами сформировались свои ферментативные комплексы, отличающиеся активностью биокаталитических реакций.

В. Ф. Купревич и Т. А. Щербакова (1966) отмечают, что важной чертой ферментативных комплексов почв является упорядоченность действия имеющихся групп ферментов, которая проявляется в том, что обеспечивается одновременное действие ряда ферментов, представляющих различные группы; исключаются образование и накопление соединений, имеющихся в почве в избытке; излишки накопившихся подвижных простых соединений (например, NH 3) тем или иным путем временно связываются и направляются в циклы, завершающиеся образованием более или менее сложных соединений. Ферментативные комплексы являются уравновешенными саморегулирующимися системами. В этом основную роль играют микроорганизмы и растения, постоянно пополняющие почвенные ферменты, так как многие из них являются короткоживущими. О количестве ферментов косвенно судят по их активности во времени, которая зависит от химической природы реагирующих веществ (субстрата, фермента) и от условий взаимодействия (концентрации компонентов, рН, температуры, состава среды, действия активаторов, ингибиторов и т.д.).

В данной главе рассматривается участие в некоторых химических почвенных процессах ферментов из класса гидролаз - активность инвертазы, уреазы, фосфатазы, протеазы и из класса оксиредуктаз - активность каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы, имеющих большое значение в превращении азот- и фосфорсодержащих органических веществ, веществ углеводного характера и в процессах образования гумуса. Активность этих ферментов - существенный показатель плодородия почв. Кроме того, будет охарактеризована активность этих ферментов в лесных и пахотных почвах разной степени окультуренности на примере дерново-подзолистых, серых лесных и дерново-карбонатных почв.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Инвертаза - катализирует реакции гидролитического расщепления сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы, воздействует также на другие углеводы с образованием молекул фруктозы - энергетического продукта для жизнедеятельности микроорганизмов, катализирует фруктозотрансферазные реакции. Исследования многих авторов показали, что активность инвертазы лучше других ферментов отражает уровень плодородия и биологической активности почв.

Уреаза- катализирует реакции гидролитического расщепления мочевины на аммиак и диоксид углерода. В связи с использованием мочевины в агрономической практике необходимо иметь в виду, что активность уреазы выше у более плодородных почв. Она повышается во всех почвах в периоды их наибольшей биологической активности - в июле - августе.

Фосфатаза (щелочная и кислая) - катализирует гидролиз ряда фосфорорганических соединений с образованием ортофосфата. Активность фосфатазы находится в обратной зависимости от обеспеченности растений подвижным фосфором, поэтому она может быть использована как дополнительный показатель при установлении потребности внесения в почвы фосфорных удобрений. Наиболее высокая фосфатазная активность в ризосфере растений.

Протеазы - это группа ферментов, при участии которых белки расщепляются до полипептидов и аминокислот, далее они подвергаются гидролизу до аммиака, диоксида углерода и воды. В связи с этим протеазы имеют важнейшее значение в жизни почвы, так как с ними связаны изменение состава органических компонентов и динамика усвояемых для растений форм азота.

Каталаза - в результате ее активирующего действия происходит расщепление перекиси водорода, токсичной для живых организмов, на воду и свободный кислород. Большое влияние на каталазную активность минеральных почв оказывает растительность. Как правило, почвы, находящиеся под растениями с мощной глубоко проникающей корневой системой, характеризуются высокой каталазной активностью. Особенность активности каталазы заключается в том, что вниз по профилю она мало изменяется, имеет обратную зависимость от влажности почв и прямую - от температуры.

Полифенолоксидаза и пероксидаза - им в почвах принадлежит важная роль в процессах гумусообразования. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. При этом ее роль состоит в активировании перекисей, поскольку они обладают слабым окисляющим действием на фенолы. Далее может происходить конденсация хинонов с аминокислотами и пептидами с образованием первичной молекулы гуминовой кислоты, которая в дальнейшем способна усложняться за счет повторных конденсаций (Кононова, 1963).

Замечено (Чундерова, 1970), что отношение активности полифенолоксидазы (S) к активности пероксидазы (D), выраженное в процентах (), имеет связь с накоплением в почвах гумуса, поэтому эта величина получила название условный коэффициент накопления гумуса (К). У пахотных слабоокультуренных почв Удмуртии за период с мая по сентябрь он составил: у дерново-подзолистой - 24 %, у серой лесной оподзоленной - 26 и у дерново-карбонатной почвы - 29 %.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПОЧВАХ

Биокаталитическая активность почв находится в значительном соответствии со степенью обогащенности их микроорганизмами (табл. 11), зависит от типа почв и изменяется по генетическим горизонтам, что связано с особенностями изменения содержания гумуса, реакции, Red-Ox-потенциала и других показателей по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Как в одних, так и в других почвах все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или А п, имеют низкую активность ферментов, незначительно изменяющуюся в положительную сторону при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой оказывается резко сниженной, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных видах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

11. Сопоставление биогенносга и ферментативной активности почв Среднего Предуралья (Пухидская, Ковриго, 1974)

Активность биокаталитических реакций почв изменяется. Наименьшая она весной и осенью, а наиболее высокая обычно в июле-августе, что соответствует динамике общего хода биологических процессов в почвах. Однако в зависимости от типа почв и их географического положения динамика ферментативных процессов весьма различна.

Контрольные вопросы и задания

1. Какие соединения называют ферментами? Каковы их продуцирование и значение для живых организмов? 2. Назовите источники почвенных ферментов. Какую роль играют отдельные ферменты в почвенных химических процессах? 3. Дайте понятие о ферментативном комплексе почв и его функционировании. 4. Дайте общую характеристику течения ферментативных процессов в целинных и пахотных почвах.

Введение...3

1. Обзор литературы...5

1.1 Понятие о ферментативной активности почв...5

1.2 Влияние тяжелых металлов на ферментативную активность

1.3. Влияние агрохимических средств на ферментативную активность почв...23

2. Экспериментальная часть...32

2.1 Объекты, методы и условия проведения исследований...32

2.2. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной свинцом...34

2.2.1. Агрохимическая характеристика почвы при загрязнении свинцом и содержание его в почве опыта...34

2.2.2. Влияние агрохимических фонов на урожай яровых зерновых культур в фазе колошения на почве, загрязненной свинцом...41

2.2.3. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность почвы, загрязненной свинцом...43

2.3. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной кадмием...54

2.3.1. Агрохимическая характеристика почвы при загрязнении кадмием и содержание его в почве опыта...54

2.3.2. Влияние агрохимических фонов на урожай яровых зерновых культур в фазе колошения на почве, загрязненной кадмием...60

2.3.3. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность почвы, загрязненной кадмием...62

2.4. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной цинком...69

2.4.1. Агрохимическая характеристика почвы при загрязнении цинком и содержание его в почве опыта...69

2.4.2. Влияние агрохимических фонов на урожай яровых зерновых культур в фазе колошения на почве, загрязненной цинком...75

2.4.3. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность

почвы, загрязненной цинком...76

2.5. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной медью...82

2.5.1. Агрохимическая характеристика почвы при загрязнении медью и содержание его в почве опыта...83

2.5.2. Влияние агрохимических фонов на урожай яровых зерновых культур в фазе колошения на почве, загрязненной медью...89

2.5.3. Влияние агрохимических фонов на ферментативную активность

почвы, загрязненной медью...90

Заключение...96

Выводы...99

Список литературы...101

Приложение

Введение

Введение.

Использование агрохимических средств в агроэкосистеме является важнейшим условием развития современного земледелия. Это продиктовано необходимостью поддержания и улучшения уровня плодородия почв, и, как следствие, получение высоких и стабильных урожаев.

Агрохимические средства выполняют целый ряд экологических функций в агроценозе (Минеев, 2000). Одной из важнейших функций агрохимии является снижение негативных последствий от локального и глобального техногенного загрязнения агроэкосистем тяжелыми металлами (ТМ) и другими токсическими элементами.

Агрохимические средства снижают негативное влияние ТМ несколькими путями, в том числе инактивацией их в почве и усилением физиологических барьерных функций растений, препятствующих поступлению в них ТМ. Если по вопросу инактивации ТМ в почве в литературе встречается много сведений (Ильин, 1982 и т. д, Обухов, 1992, Алексеев, 1987 и др.), то по усилению барьерных функций растений - единичные исследования. Благодаря усилению физиологических барьерных функций под действием агрохимических средств, в растения поступает значительно меньше ТМ при их одинаковом содержании на разных агрохимических фонах (Соловьева, 2002). Усиление барьерных функций сопровождается оптимизацией питания растений, и как следствие улучшением биологической обстановки в почве.

Эта экологическая функция, а именно - улучшение биологической активности и структуры микробоценоза почвы загрязненной ТМ под действием агрохимических средств - пока не имеет достаточного экспериментального обоснования.

Известно, что некоторые показатели биологической активности при возникновении в почве стрессовой ситуации изменяются раньше, чем

другие почвенные характеристики, например, агрохимические (Звягинцев, 1989, Лебедева, 1984). Ферментативная активность почвы является одним из таких показателей. Многочисленными исследованиями установлено негативное влияние тяжелых металлов на активность ферментов. В тоже время известно, что агрохимические средства оказывают протекторное действие по отношению к ферментативной активности почвы. Мы попытались рассмотреть эту проблему в комплексе и выявить проявляются ли экологические защитные свойства агрохимических средств по отношению к ферментативной активности почвы при загрязнении биогенными и абиогенными металлами. Эту сторону агрохимических средств можно обнаружить только в том случае, если в разных вариантах опыта будет одинаковое количество ТМ, а такое возможно лишь при одинаковых показателях почвенной кислотности. Таких экспериментальных данных нам не удалось встретить в литературе.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие о ферментативной активности почв.

Все биологические процессы, связанные с превращением веществ и энергии в почве, осуществляются с помощью ферментов, играющих важную роль в мобилизации элементов питания растений, а так же, обуславливающих интенсивность и направленность наиболее важных биохимических процессов, связанных с синтезом и распадом гумуса, гидролизом органических соединений и окислительно-восстановительным режимом почвы (,1976; 1979 и др.).

Формирование и функционирование ферментативной активности почвы - сложный и многофакторный процесс. Согласно системно-экологической концепции он представляет собой единство экологически обусловленных процессов поступления, стабилизации и проявления активности ферментов в почве (Хазиев, 1991). Эти три звена определены как блоки продуцирования, иммобилизации и действия ферментов (Хазиев, 1962).

Ферменты в почве - это продукты метаболизма почвенного биоценоза, но мнения о вкладе различных компонентов в их накоплении противоречивы. Ряд исследователей (Козлов, 1964, 1966, 1967; Красильников, 1958; и др.) считает, что основная роль в обогащении почвы ферментами принадлежит корневым выделениям растений, другие (Кацнельсон, Ершов, 1958 и др.) - почвенным животным, большинство же (Галстян, 1963; Пейве, 1961; Звягинцев, 1979; Козлов, 1966; Дробник, 1955; Hofmann, Seegerer, 1951; Seegerer, 1953; Hofmann, Hoffmann, 1955,1961; Kiss et al., 1958, 1964, 1971; Sequi, 1974; и др.) придерживаются мнения о том, что ферментативный пул в почве состоит из внутриклеточных и внеклеточных ферментов, преимущественно микробного происхождения

Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате ферментативных процессов питательные вещества из трудно усвояемых

соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются исключительно высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Последняя особенность имеет большое значение в регулировании их активности в почве (Хазиев, 1982 и

Ферментативная активность почв по (1979 г)

складывается из:

а) внеклеточных иммобилизованных ферментов;

б) внеклеточных свободных ферментов;

в) внутриклеточных ферментов мертвых клеток;

г) внутриклеточных и внеклеточных ферментов, образованных в искусственных условиях эксперимента и не характерных для данной почвы.

Установлено, что каждый фермент действует лишь на вполне определенное вещество или сходную группу веществ и вполне определенный тип химической связи. Это вызвано их строгой специфичностью.

По своей биохимической природе все ферменты представляют собой высокомолекулярные белковые вещества. Полипептидная цепочка белков - ферментов расположена в пространстве исключительно сложным образом, неповторимым для каждого фермента. При определенном пространственном расположении функциональных групп аминокислот в молек6).

Ферментативный катализ начинается с образования активного промежуточного соединения - фермент-субстратного комплекса. Комплекс - результат присоединения молекулы субстрата к каталитически активному центру фермента. При этом пространственные конфигурации молекул субстрата несколько видоизменяются. Новое ориентированное

размещение на ферменте реагирующих молекул обеспечивает высокую эффективность ферментативных реакций, способствующих снижению энергии активации (Хазиев, 1962).

За каталитическую активность фермента ответственны не только активный центр фермента, но и вся структура молекулы в целом. Скорость ферментативной реакции регулируется множеством факторов: температурой, рН, концентрацией фермента и субстрата, наличием активаторов и ингибиторов. В роли активаторов могут выступать органические соединения, но чаще различные микроэлементы (Купревич, Щербакова, 1966).

Почва способна регулировать протекающие в ней ферментативные процессы в связи с изменением внутренних и внешних факторов посредством факторной или аллостерической регуляции (Галстян 1974, 1975). Под воздействием внесенных в почву химических соединений, в том числе удобрений, происходит аллостерическая регуляция. Факторная регуляция обусловлена кислотностью среды (рН), химическим и физическим составом, температурой, влажностью , водно-воздушным режимом и т. д. Влияние специфики почвы, содержания гумуса и биомассы и других факторов на активность ферментов, используемых для характеристики биологической активности почв, неоднозначно (Галстян, 1974; Kiss,1971,; Dalai, 1975, McBride, 1989, Tiler,1978).

Ферментативную активность почвы можно использовать в качестве диагностического показателя плодородия различных почв, потому что активность ферментов отражает не только биологические свойства почвы, но и их изменения под влиянием агроэкологических факторов (Галстян, 1967; Чундерова,1976; Чугунова, 1990 и др.).

Основные пути поступления ферментов в почву - это прижизненно выделяемые внеклеточные ферменты микроорганизмов и корней растений и внутриклеточные ферменты, поступающие в почву после отмирания почвенных организмов и растений.

Выделения ферментов в почву микроорганизмами и корнями растений обычно носит адаптивный характер в форме ответной реакции на присутствие или отсутствие субстрата для действия фермента или продукта реакции, что особенно четко проявляется с фосфатазами. При недостатке в среде подвижного фосфора микроорганизмы и растения резко усиливают выделение ферментов. На такой взаимосвязи и основано применение величины фосфатазной активности почвы как диагностического показателя обеспеченности растений доступным фосфором (Наумова, 1954, Котелев, 1964).

Ферменты, попадая из различных источников в почву, не разрушаются, а сохраняются в активном состоянии. Нужно полагать, что ферменты, являясь наиболее активным компонентом почвы, сосредоточены там, где наиболее напряженно идет жизнедеятельность микроорганизмов, то есть на поверхности раздела между почвенными коллоидами и почвенным раствором. Экспериментально доказано, что ферменты в почве находятся главным образом в твердой фазе (Звягинцев, 1979).

Многочисленные эксперименты, проведенные в условиях подавления синтеза ферментов в микробных клетках при помощи толуола (Drobnik, 1961; Beck, Poshenrieder, 1963), антибиотиков (Купревич, 1961; Kiss, 1971) или облучения (McLaren et al., 1957) свидетельствуют о том, что в почве содержится большое количество "аккумулированных ферментов", достаточное, чтобы осуществлять трансформацию субстрата в течение некоторого времени. Среди таких ферментов могут быть названы инвертаза, уреаза, фосфатаза, амилаза и др. Другие ферменты гораздо более активны в отсутствие антисептика , а значит, накапливаются в почве незначительно (а - и Р-галактозидазы, декстраназа, леваназа, малатэстераза и др.). Третья группа ферментов не аккумулируется в почве, активность их проявляется лишь в период вспышки жизнедеятельности микробов и индуцируется субстратом. Полученные к настоящему времени

экспериментальные данные свидетельствуют о различии в ферментативной активности почв разных типов (Коновалова, 1975; Звягинцев, 1976; Хазиев, 1976; Галстян, 1974, 1977, 1978; и др.).

Наиболее хорошо изученными ферментами в почве являются гидролазы, которые представляют обширный класс ферментов, осуществляющих реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные, амидные, пептидные и др. Гидролазы широко распространены в почвах и играют важную роль в обогащении их подвижными и достаточными для растений и микроорганизмов питательными веществами, разрушая высокомолекулярные органические соединения. К этому классу относятся ферменты уреаза (амидаза), инвертаза (карбогидраза), фосфатаза (фосфогидролаза) и др., активность которых является важнейшим показателем биологической активности почв (Звягинцев, 1980).

Уреаза - фермент, участвующий в регуляции азотного обмена в почве. Этот фермент катализирует гидролиз мочевины до аммиака и углекислого газа, вызывая гидролитическое расщепление связи между азотом и углеродом в молекулах органических веществ.

Из ферментов азотного обмена уреаза изучена лучше других. Она обнаруживается во всех почвах. Ее активность коррелирует с активностью всех основных ферментов азотного метаболизма (Галстян, 1980).

В почве уреаза находится в двух основных формах: внутриклеточной и внеклеточной. Наличие в почве свободной уреазы позволило Бриггсу и Сегалу (Briggs et al., 1963) выделить фермент в кристаллическом виде.

Часть внеклеточной уреазы адсорбирована почвенными коллоидами, имеющими высокое сродство к уреазе. Связь с почвенными коллоидами предохраняет фермент от разложения микроорганизмами и способствует ее аккумуляции в почве. Каждая почва имеет свой стабильный уровень уреазной активности, определяемый способностью почвенных коллоидов,

главным образом органических, проявлять защитные свойства (Звягинцев, 1989).

В почвенном профиле наиболее высокую активность фермента проявляет гумусовый горизонт, дальнейшее распределение по профилю зависит от генетических особенностей почвы.

В связи с широким применением мочевины в качестве азотного удобрения, вопросы, связанные с ее превращениями под действием уреазы, являются практически значимыми. Высокая уреазная активность большинства почв препятствует использованию мочевины в качестве универсального источника азотного питания, так как высокая скорость гидролиза мочевины почвенной уреазой приводит к локальной аккумуляции ионов аммония , повышению реакции среды до щелочных значений, и как следствие этого, потерям азота из почвы в виде аммиака (Tarafdar J. C, 1997). Расщепляя мочевину, уреаза предотвращает изомеризацию её в фототоксичный цианат аммония. Хотя сама мочевина частично используется растениями, однако в результате активного действия уреазы она не может долго сохраняться в почве. В исследованиях ряда ученых отмечено улетучивание из почвы азота мочевины в форме аммиака при высокой активности уреазы, а при внесении в почву различных ингибиторов уреазы замедлялся гидролиз мочевины и потери были меньше (Tool P. O., Morgan M. A.,1994). На скорость гидролиза мочевины в почве влияют температура (Иванов, Баранова, 1972; Галстян, 1974; Cortez et al., 1972 и др), кислотность почвы (Галстян, 1974; Моисеева, 1974 и др). Отрицательное воздействие оказывает насыщенность почвы карбонатами (Галстян, 1974), присутствие в значительных количествах солей мышьяка, цинка, ртути, сульфат-ионов, соединений меди и бора, из органических соединений существенно ингибируют уреазу алифатические амины, дегидрофенолы и хиноны (Paulson, 1970, Briggsatel., 1951).

Активность инвертазы - один из наиболее устойчивых показателей, обнаруживающий наиболее четкие коррелятивные связи с воздействующими факторами. Исследованиями (1966, 1974) установлена корреляция инвертазы с активностью других почвенных карбогидраз.

Активность инвертазы исследована во многих почвах и обсуждена в нескольких обзорных работах (Александрова, Шмурова, 1975; Купревич, Щербакова, 1971; Kiss et al.,1971, и др.). Инвертазная активность в почве убывает по профилю, коррелирует с содержанием гумуса (Пухитская, Ковриго, 1974; Галстян, 1974; Калатозова, 1975; Кулаковская, Стефанькина, 1975; Симонян, 1976; Toth, 1987 и др.). Корреляция с гумусом может отсутствовать при значительном содержании в почве алюминия , железа, натрия. Тесная связь активности инвертазы с количеством почвенных микроорганизмов и их метаболической активностью (Маштаков и др.,1954; Кацнельсон, Ершов, 1958; Козлов, 1964; Чундерова, 1970; Kiss, 1958; Hofinann, 1955 и др.) свидетельствуют о преимуществе в почве инвертазы микробного происхождения. Однако такая зависимость не всегда подтверждается (Низова, 1970), активность инвертазы значительно более устойчивый показатель и непосредственно может быть не связана с колебаниями численности микроорганизмов (Ross, 1976).

По сообщению (1974) почвы с тяжелым гранулометрическим составом обладают более высокой ферментативной активностью. Однако имеются сообщения, что инвертаза заметно инактивируется при адсорбции глинистыми минералами (Hofmann et al., 1961; Skujins, 1976; Rawald, 1970) и почвы с высоким содержанием монтмориллонита обладают низкой инвертазной активностью. Зависимость инвертазной активности от влажности и температуры почвы исследована недостаточно, хотя многие авторы объясняют сезонные изменения активности гидротермическими условиями.

Влияние температуры на потенциальную активность инвертазы подробно исследовал (1975), установив оптимум при температуре около 60°, порог инактивации фермента после прогревания почв при 70° и полную инактивацию после трехчасового прогревания при 180°С.

Многими авторами рассмотрена инвертазная активность почв в зависимости от произрастающих растений (Самцевич, Борисова, 1972; Галстян, 1974, Ross 1976; Cortez et al.,1972 и др.). Развитие лугового процесса, образование мощной дернины под травянистым покровом способствует увеличению инвертазной активности (Галстян, 1959). Однако имеются такие работы, в которых влияние растений на активность инвертазы не установлено (Коновалова, 1975).

В почвах в большом количестве имеется фосфор в форме органических соединений, поступающий с отмирающими остатками растений, животных и микроорганизмов. Высвобождение фосфорной кислоты из этих соединений осуществляется сравнительно узкой группой микроорганизмов, имеющих специфические ферменты фосфатазы (Чимитдоржиева и др., 2001).

Среди ферментов фосфорного обмена наиболее полно исследована активность ортофосфорных монофосфоэстераз (Александрова, Шмурова, 1974,; Skujins J. J., 1976; Котелев и др., 1964). Продуцентами фосфатаз преимущественно являются клетки почвенных микроорганизмов (Красильников, Котелев, 1957, 1959; Котелев и др., 1964).

Фосфатазная активность почвы определяется ее генетическими особенностями, физико-химическими свойствами и уровнем культуры земледелия. Среди физико-химических свойств почвы для фосфатазной активности особенно важна кислотность. Дерново-подзолистые и серые лесные почвы, имеющие кислую реакцию, преимущественно содержат кислые фосфатазы, в почвах со слабо щелочной реакцией преобладают щелочные фосфатазы. Следует отметить, что оптимум активности кислых

фосфатаз находится в слабокислой зоне, даже тогда, когда почвы имеют сильнокислую реакцию (Хазиев, 1979; Щербаков и др., 1983, 1988). Этот факт подтверждает важность известкования кислых почв для ускорения гидролиза сложных органических фосфатов и обогащения почвы доступным фосфором.

Наблюдаемое характерное распределение фосфатаз в почвах в зависимости от их кислотности обусловлено составом микрофлоры. В почве функционируют приспособленные к определенным условиям среды микробные сообщества, которые выделяют ферменты, активные в данных условиях.

Суммарная фосфатазная активность почвы зависит от содержания гумуса и органического фосфора, который является субстратом для фермента.

Наиболее высокой фосфатазной активностью характеризуются черноземы. В дерново-подзолистых и серых лесных почвах активность фосфатазы невелика. Низкая активность этих кислых почв обусловлена более сильной адсорбцией фосфатаз почвенными минералами. Вследствие малого содержания органического вещества в таких почвах адсорбирующая поверхность минералов больше обнажена по сравнению с высокогумусными черноземами, где глинистые минералы покрыты гумифицированным органическим веществом.

Активность фосфатазы динамична в течение вегетационного периода. В активные фазы роста растений при высокой температуре почвы и достаточной влажности в летние месяцы фосфатазная активность почв максимальна (Евдокимова, 1989).

В некоторых почвах отмечена корреляция фосфатазной активности с общей численностью микроорганизмов (Котелев и др., 1964; Алиев, Гаджиев, 1978, 1979; Арутюнян, 1975, 1977; и др.) и количеством микроорганизмов, минерализующих органические соединения фосфора (Пономарева и др., 1972), в других - связь активности фосфатазы с числом

микроорганизмов не установлена (Ramirez-Martinez, 1989). Влияние гумуса проявляется в характере изменения активности фермента по профилю, при сопоставлении почв разной степени гумусированности и проведении мероприятий по окультуриванию почвы (Александрова, Шмурова, 1975; Арутюнян, 1977). Исследования многих авторов свидетельствуют о прямой зависимости фосфатазной активности почв от содержания в почве органического фосфора (Гаврилова и др., 1973; Арутюнян, Галстян, 1975; Арутюнян, 1977; и др.).

Рассмотрим несколько подробнее общие закономерности формирования фосфатазного пула почв.

Значительную часть общего фосфора в почве составляют фосфорорганические соединения: нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, фитин, лецитин и др. Большинство из встречающихся в почве органофосфатов непосредственно растениями не усваивается. Их поглощению предшествует ферментативный гидролиз, осуществляемый фосфогидролазами. Субстратами почвенных фосфатаз являются специфические гумусовые вещества, включающие фосфор гумусовых кислот, а также не специфические индивидуальные соединения, представленные нуклеиновыми кислотами, фосфолипидами и фосфопротеинами, а также метаболическими фосфатами. Первые накапливаются в почве в результате биогенеза гумусовых веществ, вторые, как правило, поступают в почву с растительными остатками и накапливаются в ней, как продукты промежуточных метаболических реакций.

Роль высших растений в формировании фосфатазного пула почв, используемых в сельском хозяйстве , ниже, чем микроорганизмов и связана в основном с поступлением в почву пожнивных остатков и корневых выделений, что подтверждается данными и (1994), которые исследовали в вегетационном опыте влияние различных сельскохозяйственных культур на активность гидролитических

и окислительно-восстановительных ферментов; фосфатазы, инвертазы, протеазы, уреазы, каталазы на маломощной торфяной почве. Активность фосфатазы оказалась примерно одинаковой под всеми культурами: ячменем, картофелем и черным паром и лишь немного больше под многолетними травами, тогда как активность других ферментов значительно различалась в зависимости от характера использования почв.

, (1972) отмечают увеличение активности фосфатазы в ризосфере пшеницы и бобовых, что может быть связано как с увеличением численности микроорганизмов в ризосфере, так и с внеклеточной фосфатазной активностью корней. С агрохимической точки зрения важен конечный результат - рост ферментативного пула почв с увеличением мощности корневых систем растений.

Обедненность агроценозов растениями приводит к снижению ризосферного эффекта и, как следствие, к уменьшению активности фосфатазы почвы. Отмечено значительное снижение фосфатазной активности почв при возделывании монокультуры. Включение почв в севооборот создает условия для улучшения гидролитических процессов, что приводит к увеличению метаболизма фосфорных соединений. (Евдокимова, 1992)

(1994) исследовала дерново-подзолистые почвы, сформированные под естественной (лесной) растительностью разного состава и определяла распределение фосфатазной активности в профиле почвы, соотношение между лабильными и стабильными формами ферментов, пространственную и временную их вариабельность. Установлено, что в почвах, сформированных под естественной лесной растительностью, генетические горизонты различаются по активности фосфатазы, распределение которой в профиле тесно коррелирует с содержанием гумуса. По данным, наибольшая фосфатазная активность наблюдалась в подстилочном слое, затем в раз уменьшалась в гумусово-аккумулятивном и резко падала в почвенном слое

ниже 20 см в почве под ельником (лесная растительность). Под луговой растительностью несколько иное распределение: максимальная активность в дерновом горизонте, в 1,5-2 раза ниже в гумусово-аккумулятивном, а дальнейшее значительное снижение наблюдается только после 40 - 60 см. На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что максимальный вклад в формирование фосфатазного пула под естественной растительностью вносят микроорганизмы и растительные остатки в качестве субстрата, корневые выделения и постморально поступающие внутриклеточные ферменты играют несколько меньшую роль.

Интенсивность биохимических процессов в почве и уровень её плодородия зависит как от условий существования живых организмов, которые поставляют ферменты в почву, так и от факторов, способствующих закреплению ферментов в почве и регулирующих их актуальную активность.

1.2. Влияние тяжёлых металлов и микроэлементов на ферментативную активность почв.

Одним из перспективных направлений использования ферментативной активности для диагностики биологических свойств почв является выявление уровня загрязненности почв ТМ.

Тяжелые металлы, поступая в почву в виде различных химических соединений, могут накапливаться в ней до высоких уровней, представляющих существенную опасность для нормального функционирования почвенной биоты. В литературе накоплено большое количество данных, свидетельствующих о негативном влиянии загрязнения почв ТМ на почвенную биоту. При нарушении химического равновесия в почве возникает стрессовая ситуация. Существуют данные о том, что биологические показатели раньше агрохимических реагирует на изменение условий, влияющих на различные свойства почвы (Лебедева,

Список литературы